A seguito di ricorso per riconoscimento di paternità promosso dalla madre per due minori al Tribunale dei Minorenni, si è sviluppata sia in primo grado che in appello una discussione sull'applicazione dei moderni metodi di riconoscimento di paternità attraverso l'esame del DNA.

Richiesta di un esame di recente acquisizione in genetica forense, conosciuto come "determinazione dell'aplotipo del cromosoma Y”.

Con  ricorso introduttivo del 6/3/1997,  notificato agli  eredi ….. il 24-28/4/1997 con il  decreto di fissazione dell'udienza, la ……. ha chiesto la dichiarazione giudiziale di paternità dei  figli minori nei confronti degli eredi di …………..

 Conclusa la fase della cosiddetta prova storica, è stato espletato l'ul­teriore mezzo istruttorio richiesto e cioè la nomina di consulente tecnico per effettuare un completo ed approfondito accertamento ematologico-genetico attraverso la tipizzazione di 10 sistemi molecolari di marcatori ipervariabili di D.N.A. per pervenire ad una probabilità che rasenti la certezza matematica.

 Si rileva che i C.T.U. non hanno fornito alcun documento o risultato delle numerose analisi effettuate, limitandosi a riportare i risultati ritenuti utili, con un modo di procedere quantomeno superficiale.

 Non si vuole mettere in dubbio la preparazione scientifica dei C.T.U. ma si ritiene che essi siano sicuramente esperti in medicina legale con indubbi meriti scientifici, ma non sufficientemente esperti sulle indagini biologiche di paternità attraverso l’identificazione genetica.

 La stessa domanda, fatta in sede di chiarimenti dall’avvocato di controparte su indicazione del proprio C.T.P., se i CTU avessero seguito un esatto approccio metodologico, domanda che non ha avuto seguito, dimostra che qualche dubbio sull’esattezza delle ricerche effettuate è venuto anche alla parte resistente.

 Le conclusioni dei C.T.U. proff.ri …………. non hanno invece fornito risposta certa, limitandosi ad un risultato di “probabile incompatibilità biologica” che lascia perplessi, come lasciano perplessi i successivi chiarimenti forniti in udienza, laddove gli stessi C.T.U. hanno lasciato chiaramente intendere che i dati forniti potevano anche ritenersi utili per dichiarare una probabile paternità, ma che i risultati ottenuti erano pochi e che non erano sicuri di poter ottenere maggiori risultati con il prelievo di cellule dal cadavere, che poteva aver subito contaminazioni e altre ne poteva subire.

 La stessa domanda, fatta in sede di chiarimenti dall’avvocato di controparte su indicazione del proprio C.T.P., se i CTU avessero seguito un esatto approccio metodologico, domanda che non ha avuto seguito, dimostra che qualche dubbio sull’esattezza delle ricerche effettuate è venuto anche alla parte resistente.

 Invero, sia pur da profani e sulla base delle nozioni acquisite in corso di causa e per ricerche personali, il dubbio che i CTU non abbiano avuto il giusto approccio metodologico è sorto e si è consolidato, soprattutto dopo essere venuti a conoscenza della raccomandazione 1998-1999 del GEFI (Gruppo degli Ematologi Forensi Italiani) sulle indagini biologiche di paternità ed indagini di identificazione criminale, che si allega alla presente memoria.

 Da tale raccomandazione è dato rilevare che “è consigliabile indirizzare le indagini verso lo studio delle sequenze microsatelliti (short tandem repeat STR)” (pag.4) che ha “un ruolo predominante nel settore” (pag.6), cioè quella ricerca che i CTU hanno eseguito solo in un secondo momento senza ottenere risultati, almeno per quanto hanno riferito, mancando, come detto, agli atti elementi da cui poter desumere i risultati.

 Sempre dalla raccomandazione si rileva che “nell’ambito della diagnosi di paternità, il numero di marcatori dovrebbe essere esteso al punto da consentire di ottenere non meno di 3 incompatibilità…Se, malgrado un adeguato numero di marcatori analizzati (non meno di 10) si trovassero solamente 2 incompatibilità, allora si dovrà verificare…” (pag. 5).

 Nel nostro caso, i CTU hanno riscontrato una sola incompatibilità per cui la conclusione non può che essere di probabile compatibilità, in quanto “tutte le prove di accertamento parentale devono concludersi con la valutazione probabilistica delle prove di compatibilità ovvero l’enunciazione chiara delle incompatibilità” (pag.7).

 La raccomandazione GEFI non pone limiti alla ricerca dei polimorfismi del DNA ed indica specificamente il prelievo di reperti previa esumazione del cadavere (pag.7) nonché la possibilità di analisi di bulbi di formazioni pilifere, frammenti di organi e tessuti tra cui in particolare denti ed ossa, preparati istologici e materiale da istoteca (pag.9).

 Si insiste, pertanto, nella richiesta di ulteriori accertamenti previa esumazione del cadavere dello …….., ed anche a mezzo di altro CTU, indicando all’uopo l’Istituto di Medicina Legale di Pavia o dell’Università Cattolica del Sacro Cuore di Roma, specializzati nelle ricerche sul DNA.

 In ogni caso, la prova storica dei rapporti tra la ……. e lo ……. è stata fornita ed anche i risultati della CTU possono essere valutati positivamente dal Giudice.

 “Anche un indice di plausibilità della paternità del 95,86% determinato da esiti di consulenza tecnica d'ufficio (ai quali non è attribuita forza decisiva) è sufficiente a far ritenere provata la paternità naturale quando si abbia la piena concordanza delle indicazioni peritali con gli ulteriori elementi probatori acquisiti, delibati sia singolarmente che nella loro reciproca concatenazione e quindi composti in un quadro unitario, nel quale nessuna smagliatura logica possa rinvenirsi.” (Tribunale minorenni Catania, 24 ottobre 1991).

Con ricorso del 5/10/2001, ………  proponeva appello avverso la sentenza n. 9/2001 del Tribunale per i Minorenni di ……., emessa il 11/5/2001 ed a seguito del detto appello, la Corte di Appello disponeva la riesumazione del cadavere di ………. per espletare i prelievi necessari per l’analisi del D.N.A., ma gli appellati si opponevano a tale riesumazione sulla base di un parere pro veritate.

L’appellante avanzava richiesta di sostituzione del CTU, per cui veniva nominato quale C.T.U. il dr. …… per valutare, sulla scorta della perizia già in atti e del parere pro veritate, la necessità di procedere alla riesumazione, ed il dr. ……… esprimeva il parere, che si impugna e contesta, della presumibile incompatibilità tra lo Scavone ed i minori Bianchini e della mancanza di necessità della già disposta riesumazione.

Ci si riporta a tutte le deduzioni e difese espletate in corso di causa.

Come già ampiamente osservato, e ribadito nel parere pro veritate  del 16/9/2002 del Dr. F. F., Biologo Molecolare Direttore Tecnico Laboratorio “…….” di …….., del quale parere il dr. …… evidentemente non ha tenuto conto, e come nuovamente ribadito nelle considerazioni aggiuntive a detto parere tecnico, che si allegano e, per completezza, qui si riportano:

"l’accertamento tecnico genetico per valutare l’esistenza di un rapporto di filiazione tra il defunto …….. e i minori ………….., condotto dai CTU professori ………….., presenta delle profonde lacune che pongono dei pesanti dubbi circa l’attendibilità e la genuinità dei risultati. I punti principali a supporto di questa tesi vengono riassunti di seguito:

A) Inadeguatezza della strategia analitica usata

I CTU, professori …………., hanno impiegato metodiche analitiche obsolete, assolutamente non idonee ad essere applicate ai reperti in questione, considerata la loro tipologia, il loro stato degradazione e di conservazione. Ciò ha prodotto un risultato dubbio, sia in termini di attribuzione che di esclusione della paternità in questione, e questo principalmente per tre motivi:

·        lo scarso potere discriminante dei marcatori genetici investigati;

·        la natura dei campioni biologici da analizzare, che poco si prestavano alla tipologia d’esame scelta dai CTU.

·        la scarsa sensibilità delle metodiche applicate per lo studio dei citati marcatori genetici in presenza di quel particolare tipo di reperti biologici.

Con la loro discutibile strategia operativa i CTU hanno contravvenuto a qualsiasi good practice di laboratorio, nonché alle direttive delle linee guida nazionali (elaborate dai Genetisti Forensi Italiani – GeFI - e dalla Società Italiana di Genetica Umana – SIGU) ed internazionali (European Network of Forensic Science Institute – ENFSI; European DNA Profiling Group – EDNAP).

Per esempio, prendendo in considerazione i risultati ottenuti dall’analisi del locus HLA-DQA1, il genotipo ricavato dai reperti autoptici relativi a …….. è risultato OMOZIGOTE 1.2/1.2, mentre quello di O. B. è risultato 2/3. Essendo la madre di O. 1.1/3 necessariamente il padre biologico deve aver trasmesso l’allele 2. La non adeguatezza della metodica impiegata, unitamente alla scarsa qualità del DNA o il suo stato di degradazione, potrebbe aver portato ad una perdita allelica (allele 2), con conseguente errata genotipizzazione. Esempi del genere sono ampiamente descritti in letteratura (Wilson et al. For. Sci. Int. 66 9-22, 1994; Comey et al. JFS 36:6 1633-1648, 1991),

Quindi, sebbene il genotipo paterno sia stato genotipizzato 1.2/1.2 omozigote, l’evenienza di una perdita dell’allele 2 può portare ad una falsa incompatibilità; con il citato allele, invece, si sarebbe ottenuta una piena compatibilità genetica fra …….. e ………..

B) Forti dubbi sulla genuinità dei risultati ottenuti.

I profilo genetico ottenuto dai CTU dal tessuto cadaverico potrebbe non appartenere al defunto ………., bensì essere il risultato di una contaminazione esterna.

A sostegno di questa ipotesi vi è il fatto che i CTU, nel tentativo di ampliamento delle indagini, affermano di non essere riusciti ad ottenere nessun risultato analizzando i medesimi reperti con l’uso di un sequenziatore automatico e con l’analisi di marcatori STR. In pratica, i CTU hanno ottenuto un risultato genotipico positivo con una metodologia inadeguata, all’epoca obsoleta e poco sensibile, ed invece non hanno ottenuto alcun risultato con una tecnica più sofisticata e sensibile. Qualunque biologo molecolare o genetista forense sa che è praticamente impossibile, analizzando i medesimi campioni biologici, che si riesca ad ottenere una genotipizzazione positiva con l’uso di marcatori e metodologia ASO o VNTR, e nessun risultato con l’impiego di marcatori STR e tecnologia fluorescente automatizzata.

E’ quindi doveroso considerare anche la possibilità che, durante la fase analitica, i CTU possano essere incorsi in una contaminazione da materiale cellulare esterno.

C) Possibilità di errore nella interpretazione dei dati.

I CTU, nella loro relazione, non hanno allegato nessuna documentazione fotografica relativa ai risultati dell’analisi (per esempio qualche immagine delle strips dalle quali è stata effettuata la genotipizzazione ASO, o la foto di qualche gel in cui è stato tipizzato il D1S80), cosa che ogni CTU o perito usualmente aggiunge per comprovare i risultati a cui è pervenuto. E’ ovvio che ciò è fondamentale per rendere una relazione tecnica oggettiva ed incontestabile.

Bisogna considerare anche la possibilità che i CTU possano essere incorsi in un errore di genotipizzazione (questo non può essere escluso data la strategia analitica scelta e l’impossibilità di apprezzare direttamente i risultati ottenuti mediante la relativa documentazione fotografica).

Per la valutazione dei risultati genotipici dell’indagine di paternità in argomento si è pertanto costretti a far fede a quanto scritto dai CTU nella loro relazione tecnica, senza avere l’opportunità di valutare la correttezza nella interpretazione dei dati ottenuti.

Per esempio,  l’assegnazione allelica per il locus D1S80, trattandosi di sistema manuale, è stata effettuata con l’occhio dell’operatore, mediante la comparazione dei campioni in esame con un “ladder” allelico (le diverse forme alleliche possibili per quel locus), senza avere la possibilità di una assistenza computerizzata. Questo genere di genotipizzazione è molto soggetto a variabilità dovute a differenze in migrazione elettroforetica dei prodotti di PCR, per cui qualche volta può risultare non corretta. E’ molto importante, quindi, produrre a corredo della relazione tecnica una fotografia del relativo gel in cui si è effettuata l’elettroforesi. 

D) Elevata frequenza delle mutazioni

I marcatori genetici investigati durante l’esecuzione di un test del DNA per valutare l’esistenza di un rapporto di filiazione possono incorrere in eventi di mutazione.

Questo concetto è fondamentale e non si può prescindere dal tenerlo in considerazione quando si valutano genotipi allo scopo di determinare un eventuale rapporto di filiazione.

Gli eventi di mutazione si possono verificare durante la fase di produzione dei gameti umani (spermatozoo o cellula uovo) e consistono nell’alterazione di una porzione genica diversa (a causa della mutazione) rispetto alla medesima regione genica del genitore (l’uomo o la donna che hanno prodotto i gameti). Quando, per esempio, uno spermatozoo mutante feconda una cellula uovo, il genotipo del nascituro, in quella regione genica, sarà incompatibile, ma solo apparentemente perché il gamete del presunto padre è incorso in un evento di mutazione; egli comunque sarà il vero padre biologico.

Il fenomeno delle mutazioni ricorre con una frequenza relativamente elevata (compresa tra 0.01% - 0.3%). Ciò impone l’analisi di un certo numero di marcatori genetici (12-15), e soprattutto l’individuazione di almeno tre incompatibilità genetiche per dichiarare esclusa una paternità.

E) L’esclusione dell’esistenza di un rapporto di filiazione deve avvenire con almeno tre incompatibilità.

Confrontando il profilo genetico ottenuto dai reperti autoptici di ………., prima con O. B. poi con R. B., per 6 loci analizzati si ottiene un risultato di piena compatibilità genetica, ed una singola incompatibilità genetica per ciascuna comparazione. R. non è compatibile per un solo locus (D1S80), mentre O. non è compatibile un solo locus (HLA-DQA1).

Queste incompatibilità sono molto probabilmente riconducibili ad eventi di mutazione e non possono essere utilizzati per escludere il rapporto di filiazione tra R. e O. B. e …………...

Nella letteratura scientifica che si occupa della genetica forense sono innumerevoli le pubblicazioni riguardanti casi di paternità controverse; in nessun caso una paternità è  stata considerata esclusa solamente con una singola regione incompatibile!

Questa affermazione è supportata da numerose pubblicazioni (linee guida del GeFI - Genetisti Forensi Italiani, della Società Italiana di Genetica Umana – SIGU, dell’European Network of Forensic Science Institute – ENFSI; e del-l’European DNA Profiling Group – EDNAP).

Citiamo fra tutte la Raccomandazione 1998-1999 del GeFI (Genetisti Forensi Italiani ), di cui è presidente il prof. Vincenzo PASCALI, e della Società Italiana di Genetica Umana (SIGU) sulle indagini biologiche di paternità e le indagini di identificazione criminale:

 “Si deve sottolineare che, nell’ambito delle diagnosi di paternità il numero di marcatori dovrebbe essere esteso al punto da consentire di ottenere non meno di 3 incompatibilità…. Se, malgrado un adeguato numero di marcatori analizzati (non meno di 10) si trovassero solamente 2 incompatibilità, allora si dovrà verificare se l’ipotesi di condivisione casuale dei marcatori compatibili sia più o meno consistente della possibilità di mutazioni concomitanti.”

Gli stessi CTU professori ………….., nelle “considerazioni” del loro elaborato, e ribadito nuovamente nelle loro note suppletive in risposta ad un ulteriore quesito da parte della Corte d’Appello di ………, concordano con quanto sopra affermato: “….. è prassi consolidata in Medicina Legale affermare una incompatibilità certa solo in presenza di due o più incongruenze genetiche …… tutto ciò impone maggiori cautele ed obbliga ad accettare il risultato ottenuto con critica valutazione……”.

Con i dati genetici a disposizione non è possibile esprimere un giudizio di esclusione della paternità in argomento; tanto meno si può parlare di probabile incompatibilità (a causa della possibilità di incorrere nelle citate mutazioni).

F) Necessità di ripetere l’esame su nuovi prelievi di tessuto cadaverico.

Così come peraltro ribadito dai CTU professori ………… al riguardo:“…il grado di attendibilità di detta incompatibilità (aggiungeremmo “genetica, dovuta ad incongruenza su di un unico marcatore”,  e non parentale) andrebbe però ulteriormente verificato ed eventualmente incrementato fino a livelli di ragionevole certezza medico-legale attraverso l’esumazione della salma ………… e lo studio di un più ampio materiale biologico allo scopo repertato”.

G) Non pertinenza della assunzione della probabilità di non paternità.

I Professori …………….. hanno ritenuto opportuno avvalorare l’ipotesi di probabilità di non paternità, raggiungendo delle conclusioni che contraddicono ogni buona norma di laboratorio e si contrappongono a linee guida nazionali ed internazionali, su cui si basa tutta la comunità scientifica che si occupa dell’analisi del DNA a fini di indagini di paternità, di cui peraltro loro stessi fanno parte!  Il calcolo di probabilità prodotto dai professori …………., basato sull’ipotesi di probabilità di non paternità, risulta non pertinente e non può essere quindi applicato al caso in questione.

Dalla lettura dei punti di cui sopra emerge con chiarezza che i risultati  dell’accertamento tecnico genetico condotto dai CTU professori ………. sono viziati da profonde lacune derivanti dalla inadeguatezza della procedura analitica ed interpretativa usata, che pongono pesanti dubbi circa l’attendibilità e la genuinità dei risultati. Gli stessi CTU convengono con ciò, laddove sottolineano che “l’indagine risente, purtroppo, del modesto numero di polimorfismi per i quali si sono ottenute risposte valutabili e del materiale su cui si è dovuto operare.....nel caso in studio...vi è l’aggravante che l’oggetto delle indagini era costituito da materiale proveniente da una esumazione....che ha subito una fissazione e, successivamente, tutti i trattamenti necessari ad uno studio anatomo-patologico.

 Tutto ciò, quindi, impone maggiori cautele ed obbliga ad accettare il risultato con critica valutazione”.

Considerati i forti dubbi sui risultati ottenuti si ritiene che non sia giustificabile quanto affermato dal CTU Dr. …….. nella sua relazione, laddove dichiara inammissibile la nuova esumazione della salma dello Scalone. E’ invece, indispensabile e doveroso ripetere l’esame su nuovi prelievi di tessuto cadaverico, così come peraltro ribadito dagli stessi CTU, professori ………..:“…il grado di attendibilità di detta incompatibilità.....andrebbe però ulteriormente verificato ed eventualmente incrementato fino a livelli di ragionevole certezza medico-legale attraverso l’esumazione della salma …… e lo studio di un più ampio materiale biologico allo scopo repertato”, ciò per “...un ampliamento delle indagini stesse servendosi di attrezzature più sofisticate nella speranza di poter ovviare ai limiti derivanti dalla qualità del materiale in studio....”.

La nuova esumazione rappresenta l’unico modo per dirimere definitivamente qualsiasi dubbio sulla vicenda ed accertare, finalmente, quale sia realmente la verità.

E’ importante sottolineare che, per quanto non sia semplice estrarre il DNA da reperti provenienti da una riesumazione di una salma sepolta da diversi anni, le tecnologie oggi a disposizione dei genetisti forensi presentano una sensibilità tale da poter considerare molto probabile l’ottenimento di un profilo genetico utile ad un confronto da un reperto di questo genere. Basti pensare che con l’attuale tecnologia è possibile ricavare profili genetici anche da tracce biologiche microscopiche o estremamente degradate, e perfino da mummie o reperti fossili.

In ultima analisi, nel caso in cui l’Ecc.ma Corte di Appello dovesse ritenere non accettabile la richiesta di una nuova esumazione, si può comunque pervenire ad un risultato similare effettuando un esame di recente acquisizione in genetica forense, conosciuto come “determinazione dell’aplotipo del cromosoma Y”.

In ambito forense, lo studio dei polimorfismi del cromosoma Y consente la risoluzione di vicende particolarmente complesse, quando i metodi ordinari sono insufficienti. La possibilità d’analisi su campioni molto ridotti o degradati, consente inoltre di affrontare casi tipici forensi, come il caso in questione.

In pratica, si parte dal presupposto che, nei soggetti di sesso maschile, la trasmissione del cromosoma Y (che, ricordiamo, determina il sesso maschile, XY) avviene attraverso la linea paterna. Ciò comporta che il cromosoma Y venga ereditato praticamente inalterato da padre in figlio. Quindi, analizzando una serie di marcatori polimorfici STR situati lungo il cromosoma Y, si potrà definire uno specifico “aplotipo” (in pratica una sequenza di “numeri”, che definiscono alleli, che determinano una specie di codice), che a sua volta sarà trasmesso inalterato da padre in figlio. Per esempio, se un soggetto di sesso maschile presenta il seguente aplotipo: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; il figlio di quest’ultimo erediterà il medesimo aplotipo 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8. Allo stesso modo, due fratelli, figli dello stesso padre, erediteranno il medesimo aplotipo del cromosoma Y.

Nel caso di una paternità controversa, quando un figlio di sesso maschile sia al centro della contesa, qualora il padre presunto non sia disponibile, ma lo siano soggetti di sesso maschile ad esso correlati (come il caso in argomento), l’esame dell’aplotipo del cromosoma Y diventa determinante per risalire all’identità del padre presunto.

Dal confronto degli aplotipi del cromosoma Y, per esempio tra il fratello del defunto, …………… (che, avendo lo stesso genitore del defunto SCAVONE Rocco avrà ereditato il medesimo aplotipo del cromosoma Y) ed i figli della sig.ra ……………, i minori ……………, se il sig. ………. risulterà possedere un aplotipo dell’Y diverso per due o più marcatori, si potrà concludere per la non paternità biologica tra i minori ed il defunto ……... Al contrario, in caso di perfetta compatibilità tra i profili dell’Y ottenuti da …….. ed i minori …………., si potrà concludere, con certezza, per la paternità biologica tra questi ultimi ed il defunto ………..

L’analisi dell’aplotipo del cromosoma Y rappresenta un indagine che attualmente viene eseguita routinariamente nei laboratori di biologia molecolare e genetica forense. Sono a disposizione dei ricercatori diversi Kit diagnostici commerciali, ampiamente validati, quali:

AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kit – Applied Biosystems (http://www.appliedbiosystems.com/europe/yfiler.cfm);

PowerPlex^® Y-System Kit - Promega (http://www.promega.com/)

L’esame in argomento potrebbe rappresentare un valido compromesso per raggiungere una certezza analitica, evitando il ricorso ad una nuova esumazione.

Così come ampiamente ribadito nelle pagine precedenti, possiamo concludere che:

·        l’inadeguatezza della strategia analitica scelta dai CTU professori …………., non consente di attribuire ai relativi risultati ottenuti un grado di attendibilità sufficiente a trarre conclusioni univoche;

·        dai profili genetici a nostra disposizione non è assolutamente possibile concludere per una esclusione del rapporto di filiazione tra …….  e i minori …………….

·        il calcolo di probabilità prodotto dai professori …………., per i motivi precedentemente descritti, risulta non pertinente e non può essere quindi applicato al caso in questione;

·        non è possibile, altresì, esprimere un giudizio di esclusione o attribuzione della paternità in argomento, tanto meno si può parlare di probabile incompatibilità.

·        si ritiene, invece, indispensabile, allo scopo di pervenire a dei risultati definitivi, procedere con ulteriori accertamenti sul materiale biologico ottenuto a seguito di esumazione della salma di …….;

·        in virtù delle tecnologie oggi disponibili nei laboratori di genetica forense, l’analisi del DNA sul citato materiale biologico è un accertamento da considerarsi assolutamente fattibile, incaricando all’uopo personale qualificato con esperienza specifica nel settore, che impieghi metodologie basate sulla PCR fluorescente e successiva genotipizzazione mediante sequenziatore automatico a tecnologia fluorescente. E’ consigliabile indirizzare le indagini verso lo studio di marcatori STR, per un numero di almeno 12-15 loci.

·        In ultima analisi, nel caso in cui l’Ecc.ma Corte di Appello dovesse ritenere non accettabile la richiesta di una nuova esumazione, la determinazione dell’aplotipo del cromosoma Y può rappresentare un valido compromesso per raggiungere una certezza analitica.

Ci si riporta alle richieste e conclusioni dell’atto di appello.